 |
| Reindirizzamento alla versione aggiornata in corso, attendere prego o cliccare qui |
Le prime tre piattoforme di Next Generation Sequencing (NGS) sono state prodotte da tre compagnie indipendenti che, poco più tardi, sono state acquisite da grossi gruppi industriali.
Il 454 è stato il primo sequenziatore NGS lanciato sul mercato. Era prodotto dalla 454 (il sequenziatore aveva in effetti lo stesso nome dell’azienda produttrice), che fu poi acquisita da Roche. Il sistema Roche 454 si basa sulla tecnologia del pyrosequencing (così chiamato per via dei pirofosfati che vengono sfruttati nella reazione di sequenziamento). Il Roche 454 riconosce la sequenza grazie al susseguirsi di segnali luminosi causati dal distacco di un pirofosfato ogni qualvolta un nucleotide viene incorporato nel filamento in crescita. I frammenti che compongono la libreria di DNA (DNA library) vengono denaturati ad ottenere filamenti singoli che vengono catturati dagli amplification beads, piccole sfere sulla cui superficie sono ancorati oligonucleotidi che riconoscono e legano gli adattatori (adaptors), che erano stati opportunamente aggiunti alle estremità di ogni frammento (non si dimentichi che, per definizione, la DNA library - o sequencing library - è l’insieme dei frammenti di DNA preparati tramite l’aggiunta degli adattatori).
Quello che segue è un processo cosiddetto di PCR in emulsione (emulsion PCR). Gli amplificati ottenuti vengono posti sulla picotiter plate, un supporto sul quale avviene la reazione di sequenziamento vera e propria. Gli amplificati vengono qui cimentati con una soluzione contenente un solo dNTP per volta (insieme ad altri reagenti che hanno lo scopo di catalizzare l’eventuale reazione luminosa). Se il dNTP somministrato (dATP, dGTP, dCTP o dTTP) è complementare alla prima base da copiare, esso viene incorporato nel filamento in crescita scatenando una reazione luminosa causata dal rilascio del pirofostato. Il dNTP in eccesso viene poi degradato dall’enzima apirasi e lavato via. Gli amplificati vengono quindi cimentati con il dNTP successivo e così via. Come detto sopra, le reazioni luminose vengono registrate ed elaborate dalla macchina, il cui software ricostruisce la sequenza. Questo sistema, nel quale i dNTP vengono aggiunti uno alla volta ad ogni ciclo successivo, si dice sistema a interrogazione di singolo nucleotide.
Il sistema 454 è stato assai perfezionato da Roche. Il 454 GS FLX Titanium lanciato nel 2008 consente di produrre reads di ben 700 bp con un’accuratezza del 99.9% (dopo l’uso di filtri) e un output di 0,7 Gb al giorno. Il successivo perfezionamento tramite il sistema GS Junior ha portato l’output a 14 Gb per corsa. I vantaggi maggiori del sistema Roche risiedono nella velocità (le sequenze si possono ottenere in sole 10 ore!) e nella lunghezza delle reads ottenibili. Il sistema Roche resta tuttavia piuttosto costoso. Un altro punto debole sembra essere il tasso relativamente elevato di errori nella sintesi di tratti di nucleotidi ripetuti (poly-bases) superiori a 6 bp. Va comuqnue detto che gli stretch di ripetizioni di nucleotidi possono rivelarsi particolarmente difficili da caratterizzare persino nel Sanger sequencing.
Secondo quanto riportato da Liu L. 2012 (PIMD: 22829749), il prezzo di un sistema 454 GS FLX si aggira attorno ai 500.000 USD, con un costo a corsa di circa 7.000 USD.
Argomenti correlati:
- NEXT GENERATION SEQUENCING
- APPLICAZIONI DELLA NEXT GENERATION SEQUENCING
- PERSONAL GENOME MACHINES: IL MOMENTO È ARRIVATO!
- EXOME SEQUENCING
- EXOME SEQUENCING: COSTI E INDICAZIONI
- GENOME SEQUENCING
- EXOME E GENOME ARRAY
- ENRICHMENT NELLA NGS: LO STEP AGGIUNTIVO NECESSARIO
- SANGER SEQUENCING: LA STORIA COMINCIA DA QUI
- MULTIPLEXING: UN’APPLICAZIONE FORMIDABILE DELLA NGS
- ROCHE 454: UNA PIATTAFORMA NGS MOLTO VELOCE
- ILLUMINA: PIATTOFORME NGS A RESA ELEVATA
- SOLiD: LA PIATTAFORMA NGS DI APPLIED BIOSYSTEMS
Nessun commento:
Posta un commento