Per quali pazienti è indicato l'exome sequencing? Che senso ha farlo e quanto costa?
L'exome sequencing, ossia il sequenzimento dell'intera regione codificante in un sol colpo, è una metodica di recente diffusione ed è ormai molto piuttosto conosciuto anche fra i non addetti ai lavori. Per questo motivo l'exome sequencing comincia ad essere richiesto con una certa frequenza, sia dai pazienti che dai medici, anche se non sempre con cognizione di causa.
Diciamo subito che, allorquando la diagnosi clinica sia definita e il gene o i geni associati alla malattia siano noti, l'esecuzione dell'analisi di singolo gene (tramite Sanger sequencing tradizionale) o di un ristretto gruppo di geni (tramite Sanger sequencing o Next Generation Sequencing - NGS) è più che adeguata.
L'exome sequencing è in realtà indicato in tutti quei casi in cui la diagnosi clinica sia rimasta non definita, ma si sospetti comunque un'origine genetica della malattia (questa possibilità è piuttosto frequenta in genetica clinica e in particolare in dismorfologia) o allorquando, sia pure a fronte di una diagnosi clinica precisa, i geni associati alla malattia non siano noti perché non ancora scoperti dalla ricerca. Se si pensa che ben il 50% dei pazienti sindromici rimane ad oggi senza una diagnosi clinica precisa, si capisce subito che i casi in cui l'exome sequencing trova potenziale applicazione sono assai numerosi.
L'exome sequencing è una metodica che consente il sequenziamento dell'intera regione codificante e di alcune regioni non-codificanti di dimostrata importanza funzionale. In altre parole, in una corsa di exome sequencing si possono analizzare le parti codificanti di tutti i geni di un individuo. Poiché si stima che ben l'85% delle mutazioni che causano malattie genetiche caschino all'interno delle regioni codificanti del genoma, ben si intuisce quali possano essere le potenialità diagnostiche dell'exome sequencing. Lo sviluppo della tecnologia ha reso questa analisi alla portata di molte tasche. In effeti un exome sequencing oggi può costare dai 1.500 ai 3.000 EUR circa (il costo varia molto in base al servizio offerto dal laboratorio, che può includere il semplice sequenziamento o, in aggiunta, l'intepretazione medica del risultato da parte di un genetista). In molti casi, l'eseuzione dell'exome sequencing nel caso indice (vale a dire nel soggetto affetto) va seguita dal test del portatore di una o più varianti potenzialmente patogene, che devono essere indagate anche nei genitori e nei fratelli per capirne il vero significato clinico. Presso alcuni laboratori il costo del test del portatore in uno o più membri familiari è incluso nel costo iniziale, mentre altri laboratori offrono questo servizio a parte, con costi che possono diventare anche molto rilevanti (fino a 200 EUR a mutazione a persona). In altri casi (ad esempio laddove si sospetti una tramissione di tipo autosomico recessivo, ma si sia identificata una sola mutazione), può essere necessario eseguire test addizionali nel caso indice, come ad esempio l'analisi di delezione/duplicazione (tramite qPCR o MLPA, i cui costi possono variare fra i 200 e 1.000 EUR circa).
Riassumendo, l'exome sequencing è quindi indicato:
1. quando si sospetti una malattia genetica ma non sia possible addivenire ad una diagnosi clinica precisa
2. quando il gene associato alla malattia diagnosticata non sia ancora stato identificato
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L'exome sequencing, ossia il sequenzimento dell'intera regione codificante in un sol colpo, è una metodica di recente diffusione ed è ormai molto piuttosto conosciuto anche fra i non addetti ai lavori. Per questo motivo l'exome sequencing comincia ad essere richiesto con una certa frequenza, sia dai pazienti che dai medici, anche se non sempre con cognizione di causa. Diciamo subito che, allorquando la diagnosi clinica sia definita e il gene o i geni associati alla malattia siano noti, l'esecuzione dell'analisi di singolo gene (tramite Sanger sequencing tradizionale) o di un ristretto gruppo di geni (tramite Sanger sequencing o Next Generation Sequencing - NGS) è più che adeguata.
L'exome sequencing è in realtà indicato in tutti quei casi in cui la diagnosi clinica sia rimasta non definita, ma si sospetti comunque un'origine genetica della malattia (questa possibilità è piuttosto frequenta in genetica clinica e in particolare in dismorfologia) o allorquando, sia pure a fronte di una diagnosi clinica precisa, i geni associati alla malattia non siano noti perché non ancora scoperti dalla ricerca. Se si pensa che ben il 50% dei pazienti sindromici rimane ad oggi senza una diagnosi clinica precisa, si capisce subito che i casi in cui l'exome sequencing trova potenziale applicazione sono assai numerosi.
L'exome sequencing è una metodica che consente il sequenziamento dell'intera regione codificante e di alcune regioni non-codificanti di dimostrata importanza funzionale. In altre parole, in una corsa di exome sequencing si possono analizzare le parti codificanti di tutti i geni di un individuo. Poiché si stima che ben l'85% delle mutazioni che causano malattie genetiche caschino all'interno delle regioni codificanti del genoma, ben si intuisce quali possano essere le potenialità diagnostiche dell'exome sequencing. Lo sviluppo della tecnologia ha reso questa analisi alla portata di molte tasche. In effeti un exome sequencing oggi può costare dai 1.500 ai 3.000 EUR circa (il costo varia molto in base al servizio offerto dal laboratorio, che può includere il semplice sequenziamento o, in aggiunta, l'intepretazione medica del risultato da parte di un genetista). In molti casi, l'eseuzione dell'exome sequencing nel caso indice (vale a dire nel soggetto affetto) va seguita dal test del portatore di una o più varianti potenzialmente patogene, che devono essere indagate anche nei genitori e nei fratelli per capirne il vero significato clinico. Presso alcuni laboratori il costo del test del portatore in uno o più membri familiari è incluso nel costo iniziale, mentre altri laboratori offrono questo servizio a parte, con costi che possono diventare anche molto rilevanti (fino a 200 EUR a mutazione a persona). In altri casi (ad esempio laddove si sospetti una tramissione di tipo autosomico recessivo, ma si sia identificata una sola mutazione), può essere necessario eseguire test addizionali nel caso indice, come ad esempio l'analisi di delezione/duplicazione (tramite qPCR o MLPA, i cui costi possono variare fra i 200 e 1.000 EUR circa).
Riassumendo, l'exome sequencing è quindi indicato:
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2. quando il gene associato alla malattia diagnosticata non sia ancora stato identificato
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4 commenti:
Innanzitutto grazie per la spiegazione.
Mi è sorto un dubbio peró che non mi fa dormire di notte e di cui non trovo risposta da nessuna parte : spezzando il DNA in frammenti di poche bp come si riesce poi ad indicare la loro posizione all' interno del genoma? Non viene a mancare anche la sequenza completa di un gene per esempio? Se un certo gene viene spezzato in 5 frammenti A B C D E , come faccio dopo il sequenziamento a sapere che il loro ordine era A B C D E e non C E B A D?
Grazie !!
Luca
Caro Luca,
i segmenti di sequenza vengono riallineati automaticamente dal software collegato al sequenziatore. Si tratta ella cosiddetta operazione di alignment, per l'appunto: il software confronta le sequenze ottenute con le reference sequences dei database (http://lezionidigenetica.blogspot.it/2013/10/cose-una-reference-sequence.html). La sequenza genica viene così ricostruita come in un puzzle. L'operatore deve fare ben poco: il computer pensa a tutto.
Grazie per il tuo feedback. Editing Team
Ma se io ho per esempio delle ripetizioni cag , che oltre ad essere abbastanza frequenti, risulta anche importante contarle precisamente, quando inizio il NGS prendo tanti cagcagcagcagcag da piu' regioni del genoma, e avro' tanti frammenti identici, anche avendo un DNA modello non riuscirei in nessun modo a identificare la loro provenienza originaria.. Devo fare per forza un altro test, e cmq il sequenziamento non risulterebbe così preciso come invece e' sostenuto da qualsiasi rivista.
Caro Luca, devi tener presente che, una volta preparata la sequencing library, il DNA viene amplificato con primer specifici. Solitamente si utilizzano kit commerciali che contengono primer già ampiamente testati (è questo lo step del TARGET ENRICHMENT). Gli ampliconi ottenuti nello step di enrichment sono specifici e possono essere allineati sulla reference sequence in modo univoco. In linea di massima, le analisi NGS sono altamente automatizzate: basta un minima quantità di DNA del paziente, da cimentare coi kit commerciali prima e da far correre nella macchina poi. Considera che il sequenziatore non solo allinea le sequenze (alignment), ma evidenza anche tutte le varianti nucleotidiche, incluse quelle chiaramente o potenzialmente significative dal punto di vista fenotipico (variant calling).
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