Dopo i personal computer è in arrivo l'era delle perosonal genome machines...
Le PGM presentano i vantaggi tipici delle analisi NGS (velocità e costi di analisi ridotti), anche se hanno una resa (output) inferiore rispetto ai sequenziatori più grossi come il 454 Roche, il Genome Analyzer o l’HiSeq di Illumina o il SOLiD di Applied Biosystems. Attualmente ne esistono sostanzialmente tre: la Ion Torrent (disponibile nei due modelli Ion PGM e Ion Proton), il MiSeq di Illumina e il Polonator di Complete Genomics.
Ion Torrent
I sequenziatori benchtop Ion Torrent erano originariamente prodotti dalla Ion Torrent, che è stata poi acquisita da Life Technlogies. Ne esistono due modelli: la Ion PGM e la Ion Proton. Entrambe sfruttano la tecnologia del sequenziamento tramite semiconduttore. In questa tecnologia, ogniqualvolta un nucleotide viene incorporato nel filamento in crescita, viene rilasciato un protone. La macchina è in grado di capire se il nucleotide è stato incorporato percependo le variazioni di pH indotte dal rilascio del protone. Come nel sistema Roche 454, anche nella Ion PGM ogni nucleotide viene interrogato singolarmente: il supporto con il filamento in crescita viene cioè cimentato con soluzioni contenenti un solo nucleotide per volta. Se il nucleotide cimentato non è complementare, questo non si lega, nessun protone viene rilasciato e non si ha quindi nessuna variazione di pH. Se per caso vengono incorporati due nucleotidi, vi sarà una variazione di pH “doppia”, che verrà adeguatamente registrata. Ion Torrentnon utilizza molecole fluorescenti e non necessita quindi dei dispositivi di cattura e analisi della fluorescenza. Il vantaggio dei sistemi Ion Torrent risiede dunque sia nelle piccole dimesioni degli strumenti (benchtop, appunto) che nei costi di esercizio ridotti.
La Ion PGM è una piattaforma adatta al targeted sequencing, cioè al sequenziamento di pannelli di geni (ad esempio pannelli relati al cancro e ad alle malattie mendeliane caratterizzate da elevata eterogeneità genetica), all'analisi di genomi di piccole dimensioni (come quelli dei microrganismi) e al ChIP-Seq (Chromatin Immunoprecipitation Sequencing). Una corsa con Ion PGM richiede una quantità di DNA quasi irrisoria: 10 ng (similmente, per l'analisi di trascrittoma servono solo 5 ng di RNA). Anche la lunghezza delle reads ottenibili è accettabile: da 35 a 400 bp. Attraverso i kit Ion AmpliSeq, la casa fornisce anche i set di primer necessari al target enrichment (ossia all'amplificazione delle regioni genomiche o dei geni di interesse) e alla preparazione della libreria di DNA (o di RNA). Ion PGM funziona attraverso l'impiego di chip specifici, dei quali per ora ne sono disponibili tre: chip Ion 314 (1 milione di pozzetti, output di 10 Mb), chip Ion 316 (6 milioni di pozzetti, output di 100 Mb), chip Ion 318 (11 milioni di pozzetti, output di 1 Gb). Con Ion PGM si possono preparare e analizzare fino a 8 campioni in parallelo in un arco di tempo di circa 16 ore (single day workflow). Ion PGM è quindi molto veloce e può perciò essere utile anche in situazioni di emergenza, come ad esempio lo scoppio di un'epidemia, durante la quale si rende necessario identificare immediatamente il microrganismo responsabile attraverso la caratterizzazione del suo genoma (de novo sequencing). Un altro vantaggio di Ion PGM è l’elevata accuratezza dell’analisi, che tende a restare molto stabile sia dopo molto cicli che in regioni tecnicamente difficili come le isole CpG (a differenza, ad esempio, di quanto può succedere a strumenti anche più grossi come l’HiSeq, nei quali il decadimento del segnale fluorescente, dopo un certo numero di cicli, può creare qualche problema).
La Ion Proton è un po' più potente della Ion PGM ed è infatti adatta all'exome e al genome sequencing (lo slogan di Life Technologies è infatti "PGM for genes, Proton for genomes"). Anche Ion Proton funziona con tempistiche sovrapponibili a quelle della Ion PGM (single day workflow). La Ion Proton funziona con due tipi di chip: chip Proton I (160 milioni di pozzetti, adatto al sequenziamento di due esomi umani in parallelo) e chip Proton II (660 milioni di pozzetti, adatto al sequenziamento di un intero genoma umano).
MiSeq
Il MiSeq di Illumina usa la stessa tecnologia sequencing by synthesis (SBS) usata dalle sorelle maggiori Genome Analyzer e HiSeq. Anche MiSeq è estremamente veloce, poiché il risultato si ottiene in 8 ore. La resa (output) arriva fino a 15 Gb a corsa. MiSeq viene usato con i kit di enrichment prodotti da Illumina (Nextera, TruSeq). Il range di applicazioni di MiSeq è molto ampio, potendo andare dal targeted sequencing per pannelli di geni, al ChIP-Seq, al sequenziamento di genomi di piccole dimensioni. Non è tuttavia adatto all'analisi di interi esomi o genomi umani, che sono di dimensioni troppo grandi per la macchina. Per certi versi MiSeq presenta vantaggi persino maggiori di HiSeq, ad esempio nella lunghezza massima delle reads ottenibili (che vanno da singole reads di 36 bp fino a 2 reads paired-end da 300 bp). Illumina offre un sistema di analisi dei dati sul cloud, detto BaseSpace, che consente di valutare i dati e di condividerli con i colleghi in tempo reale.
Polonator
Il Polonator G.007, prodotto da Complete Genomics (società del gruppo cinese BGI Genomics), è un sequenziatore che utilizza la tecnica della ligazione. Polonator è basato su un sistema aperto piuttosto economico. Software e protocolli di sequenziamento sono infatti disponibili open-source. Pur essendo ligation-based, si differenzia dal sistema ligation-based di SOLiD per via del fatto che il coding non è a due nucleotidi, ma a singolo nucleotide in una sonda di nove (nonamero). Il sistema Polonator è basato sull’uso dei fluorofori. Complete Genomics dichiara che l’accuratezza di Polonator raggiunge il 99,999% ad un risoluzione di ben 40x. Liu L. 2012 (PIMD: 22829749), alcuni ricercatori, che hanno raffrontato il sistema Complete Genomics con il sistema HiSeq di Illumina, hanno riportato differenze notevoli nel rilevamento di varianti di singolo nucleotide e di indels.
- NEXT GENERATION SEQUENCING
- APPLICAZIONI DELLA NEXT GENERATION SEQUENCING
- EXOME SEQUENCING
- EXOME SEQUENCING: COSTI E INDICAZIONI
- GENOME SEQUENCING
- EXOME E GENOME ARRAY
- ENRICHMENT NELLA NGS: LO STEP AGGIUNTIVO NECESSARIO
- SANGER SEQUENCING: LA STORIA COMINCIA DA QUI
- MULTIPLEXING: UN’APPLICAZIONE FORMIDABILE DELLA NGS
- ROCHE 454: UNA PIATTAFORMA NGS MOLTO VELOCE
- ILLUMINA: PIATTOFORME NGS A RESA ELEVATA
- SOLiD: LA PIATTAFORMA NGS DI APPLIED BIOSYSTEMS
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