Come si prepara un campione per il sequenziamento NGS di un singolo gene, di un gruppo di geni (pannello) o dell'intero esoma?
Nella lezione Applicazioni della Next Generation Sequencing abbiamo visto che questa metodica può avere diversi impieghi, che, in genetica clinica, includono sostanzialmente (1) lo Whole-Genome Sequencing - WGS, (2) lo Whole-Exome Sequencing - WES e (3) il Targeted Sequencing (analisi di singolo gene o di un gruppo di geni). Le applicazioni (2) e (3) richiedono uno step addizionale prima della reazione di sequenziamento. Questo step è noto come Target Enrichment o più semplicemente Enrichment.
L'Enrichment si rende necessario per isolare le regioni genomiche di interesse ed ottenere da esse una quantità di DNA sufficiente all'analisi. Vediamo come si fa. All'inizio si procede normalmente alla costituizione della libreria di sequenziamento (sequencing library). Successivamente non si fa altro che ridurre la densità della libreria così ottenuta, limitando la sua consistenza alle regioni che si desidera analizzare. In alcuni sistemi (ad esempio, nel sistema Illumina) ciò viene realizzato con l'aiuto di sonde biotinilate e di granuli magnetici (magnetic beads). La sequencing library iniziale viene cioè cimentata con piccole sequenze di DNA specifiche (sonde biotinilate) che si legano alle regioni genomiche di interesse. In seguito vengono aggiunti i magnetic beads, che si legano a loro volta alle sonde biotinilate. È cosi possibile trattenere le regioni di DNA che si desidera analizzare trattenendole su un supporto magnetico mentre tutto il DNA restante viene lavato via. Le regioni di DNA così isolate possono quindi essere amplificate tramite PCR fino ad ottenere la quantità di DNA necessaria alla corsa di sequenziamento.
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