In genetica molecolare i risultati di un test possono a volte non essere semplici da interpretare. Esistono numerose linee guida su come interpretare i risultati di un test di genetica molecolare. Sono tutte più o meno simili e si rifanno in gran parte alle linee stilate dall'American College of Medical Genetics (ACMG). Sulla falsa riga di queste linee guida si possono distinguere i seguenti tipi di mutazioni:
1. MUTAZIONI GIÀ DESCRITTE IN LETTERATURA COME PATOGENICHE
Con alcune eccezioni, queste mutazioni possono essere tranquillamente interpretate come patogeniche e la loro rilevazione nel DNA del paziente consente spesso di dare una conferma genetica della diagnosi clinica. Ad esempio, la rilevazione della mutazione Arg91Gly nel gene TPM2 (Sung et al 2003) in un paziente affetto consente di confermare geneticamente una diagnosi di artrogriposi distale tipo 1 (dystal arthrogryposis 1 - DA1). una delle fonti più consultate a livello professionale per vedere se una mutazione è già stata descritta in letteratura è Human Genome Mutation Database (HGMD). Esiste una versione Professional di HGMD (a pagamento) che consente, per ogni gene, di vedere tutte (o quasi tutte) le mutazioni che sono già state descritte in letteratura. in linea di massima, HGMD Professional è abbastanza affidabile, tuttavia è necessario fare attenzione a due cose:
non tutte le mutazioni riportate in HGMD sono confermate essere patogeniche. Alcune, infatti, sono state riclassificate come neutrali o di significato incerto dopo la prima originale pubblicazione. Queste mutazioni sono di solito identificate in HGMD con la sigla DM? (Disease-causing Mutation?) a differenza delle mutazioni ritenute o confermate come patogeniche (DM, senza punto di domanda).
alcune mutazioni possono apparire in HGMD come ritenute patogeniche sulla base di un'unica pubblicazione, il cui risultato viene poi smentito da studi o evidenze successive. La sigla DM in HGMD non è quindi una garanzia totale del significato patogenico della mutazione. Ciò è vero in particolare nelle malattie a trasmissione autosomica dominante, dove le mutazioni eterozigoti missenso (tipicamente fra le più difficili da interpretare) abbondano.
2. MUTAZIONI NON PRECEDENTEMENTE DESCRITTE, MA CHE APPARTENGONO ALLA CATEGORIA DI MUTAZIONI CHE SONO VEROSIMILMENTE PATOGENICHE
Tipicamente rientrano in questa categoria tutte quelle mutazioni che si suppone generino un allele non funzionale (non-functional allele), che è di solito causa della traduzione di una proteina tronca o, più frequentemente, del decadimento dell'mRNA con conseguente perdita totale della proteina. Queste sono: le mutazioni nonsenso (che introducono un cordone di stop), le piccole delezioni o inserzioni o delezioni/inserzioni che alterano il frame di lettura dell'mRNA (frame-shifting), le mutazioni che alterano i siti donatori e accettori di splicing (tipicamente localizzate nelle posizioni cDNA +/-1 e +/-2), le grandi delezioni di uno o più esoni o dell'intero gene e spesso le grandi inserzioni o duplicazioni di uno o più esoni o dell'intero gene (non sempre un numero di copie di un gene superiore a due è patogenico, si veda ad esempio il gene SMN1, ma spesso l'effetto di questa variazione è deleterio). Infine, appartengono a questa categoria anche le mutazioni missenso che, pur essendo detectate pre la prima volta, affliggono un codone dove un'altra mutazione missenso è stata precedentemente descritta come patogenica.
3. MUTAZIONI NON PRECEDENTEMENTE DESCRITTE E CHE APPARTENGONO ALLA CATEGORIA DI MUTAZIONI CHE POTREBBERO ESSERE O NON ESSERE PATOGENICHE (COSIDETTE MUTAZIONI DI SIGNIFICATO INCERTO)
Appartengono a questa categoria tutte le nuove mutazioni missenso (tranne quelle che affliggono un codone dove un'altra mutazione missenso sia già stata descritta, vedi sopra), tutte le piccole delezioni o inserzioni o delezioni/inserzioni (delins) che non alterano il frame di lettura dell'mRNA (in-frame) e tutte le mutazioni che potrebbero attivare un sito criptico di splicing lontano dalla giunzione esone/introne (tipicamente mutazioni localizzate profondamente nell'introne o mutazioni sinonime all'interno dell'esone) o che potrebbero influenzare significativamente la funzionalità dei siti donatori e accettori conservati alla giunzione esone/introne (tipicamente localizzate entro 10-20 posizioni nucleotidiche dalla giunzione esone/introne).
Tutte le mutazioni missenso non riportate precedentemente (previously unreported) vanno considerate di significato incerto fino a che ulteriori evidenze sul loro possibile effetto non emergono da studi familiari o funzionali. Tipicamente, nei disordini a trasmissione autosomica recessiva, l'evidenza della patogenicità di una mutazione missenso omozigote si può ottenere dalla conferma biochimica della diagnosi e dall rilevazione della mutazione allo stato eterozigote nei genitori e nei fratelli/cugini non affetti. Nei disordini a trasmissione autosomica dominante, invece, l'evidenza della verosimile patogenicità della mutazione può essere invece data dal riscontro della mutazione nei soggetti affetti di diverse generazioni della stessa famiglia (trovarla solo in un genitore affetto non è garanzia sufficiente) o dal fatto che nessuno dei due genitori è portatore della mutazione, il che significa che la mutazione è insorta e novo o come conseguenza di mosaiciste germinale parentale. Lo stesse dicasi per le delezioni o inserzioni in-frame e per le mutazioni che potrebbero influire significativamente sullo splicing. In tutti i casi l'analisi in silico può venire buona per dare ulteriori indizi, ma non va mai ritenuta uno stime to esauriente per la definizione della patogenicità o meno di una mutazione di significato incerto, in quanto l'evidenza finale può venire solo dallo studio familiare e, idealmente, dallo studio funzionale in vitro. In particolare, l'analisi in silico delle mutazioni missenso può farsi con Polyphen2, SIFT, Align-GVGD e Mutation Taster, metre quelle delle putative mutazion di splicing con MaxEntScan, SpliceSiteFinder etc. Strumento consigliatissimo per l'esecuzione dell'analisi in silico è Alamut (Interactive Biosoftware). Una piccola differenza è data dal fatto che mentre tutte le mutazioni missenso sono da considerarsi a priori di significato incerto, per le putative mutazioni dello splicing è meglio fare una scrematura con l'analisi in silico. In altri termini, per queste mutazioni ci si può fidare del risultato dell'analisi tramite software per capire se c'è una possibilità che la mutazione sia fenotipi mente rilevante, anche se non si può confermare la patogenicità prima di aver fatto indagini familiari o funzionali.
Un'ultimo tipo di mutazioni che appartiene a questa categoria è quello delle mutazioni che cadono nell 5'UTR (e molto più raramente nella 3'UTR). In genere queste mutazioni non hanno un impatto patogenico. Esistono tuttavia alcuni geni dove mutazioni di questo tipo sono state dimostrate essere chiaramente mutazioni-malattia (disease-causing). Perciò, nel caso si stia analizzando uno di questi geni, si consiglia di considerare con attenzione anche le nuove mutazioni che vengono rilevate nella zona 5'UTR o 3'UTR.
4. MUTAZIONI NON PRECDENTEMENTE DESCRITTE E CHE APPARTENGONO ALLA CATEGORIA DI MUTAZIONI CHE SONO VEROSIMILMENTE NON PATOGENICHE
Questo gruppo contiene mutazioni che sono localizzate nella 5'UTR o 3'UTR (con alcune eccezioni, vedi sopra), tutte le mutazioni introniche e le mutazioni esoniche sinonime che verosimilmente non hanno un effetto sullo splicing (che non creano cioè sequenze dinucleotidiche GT o AG o che non alterano la funzionalità dei siti donatori e accettori conservati)
5. MUTAZIONI PRECEDENTEMENTE DESCRITTE COME NON PATOGENICHE
Ad esempio, mutazioni missenso che sono note in letteratura per essere semplicemente dei (rari) polimorfismi con poca o nessuna influenza sulla funzionalità finale della proteina. Più raramente possono far arte di questa categoria anche mutazioni di splicing (il cui effetto deleterio viene probabilmente evitato grazie a meccanismi cellulari di salto di lettura della mutazione) o mutazioni nonsenso (anche in questo evitate da meccanismi di salto di lettura o semplicemente localizzate alla fine del messaggero, laddove il prodotto proteico non risente della perdita di pochi residui aminoacidici alla fine della catena).
Quelle illustrate sopra sono le categorie di mutazioni da considerare dal punto di vista interpretativo. In ogni caso è sempre consigliabile per il genetista ragionare e scrivere in termini probabilistici piuttosto che assoluti, anche nel caso di mutazioni già note in letteratura, poiché le sorprese, come già accennato sopra, possono non mancare. Così, ad esempio, piuttosto che scrivere "il risultato conferma la diagnosi di" può essere raccomandabile scrivere "il risultato può essere compatibile con la diagnosi di".
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