La qPCR (acronimo che sta per quantitative PCR, altresì nota anche come RT-PCR, realt-time PCR, o qrtPCR - quantitative real-time PCR) è una reazione di polimerizzazione a catena nella quale il DNA viene non solo amplificato, ma anche quantificato. Le applicazioni principali della qPCR sono la genotipizzazione (ossia l'analisi del DNA per la caratterizzazione degli alleli a determinati locus), gli studi di espressione (ossia l'analisi del cDNA, ottenuto dalla retrotrascrizione dell'RNA) e l'analisi dei pattern di metilazione.
Semplificando, il principio è il seguente: poiché, dopo ogni ciclo di amplificazione, il DNA ottenuto può essere quantificato, è possibile dire in quale misura un allele è rappresentato rispetto ad un altro o in quale misura un gene è espresso rispetto agli altri geni della cellula.
Come è possibile procedere alla quantificazione del prodotto amplificato?
Vengono normalmente utilizzati (1) degli intercalanti fluorescenti, cioè delle molecole che si legano al DNA (tipicamente si usa il SYBR Green) o (2) delle sonde oligonucleotidiche che, essendo marcate con dei fluorofori, emanano un segnale luminoso fluorescente ogni volta che si ibridano al DNA. L'utilizzo delle sonde oligonucleotidiche garantisce una precisione maggiore poiché le sonde siibridano in modo più specifico alle sequenze target, mentre il SYBR Green si intercala in modo aspecifico all'interno di qualsiasi prodotto di amplificazione.
Semplificando, il principio è il seguente: poiché, dopo ogni ciclo di amplificazione, il DNA ottenuto può essere quantificato, è possibile dire in quale misura un allele è rappresentato rispetto ad un altro o in quale misura un gene è espresso rispetto agli altri geni della cellula.
Come è possibile procedere alla quantificazione del prodotto amplificato?
Vengono normalmente utilizzati (1) degli intercalanti fluorescenti, cioè delle molecole che si legano al DNA (tipicamente si usa il SYBR Green) o (2) delle sonde oligonucleotidiche che, essendo marcate con dei fluorofori, emanano un segnale luminoso fluorescente ogni volta che si ibridano al DNA. L'utilizzo delle sonde oligonucleotidiche garantisce una precisione maggiore poiché le sonde siibridano in modo più specifico alle sequenze target, mentre il SYBR Green si intercala in modo aspecifico all'interno di qualsiasi prodotto di amplificazione.
MACCHINARI PER LA qPCR
Le ditte che producono macchinari per la qPCR sono numerose. Qui di seguito un breve elenco dei dispositivi più diffusi sul mercato. QuantStudio™ Dx Real-Time PCR Instrument (Life Technologies)
Prodotta da uno dei giganti delle biotecnologie, Life Technologies, QuantStudio™ Dx Real-Time PCR offre la possibilità di utilizzare piastre da 96 o da 384 pozzetti o la brevettata microfluidic card, che consente di saltare lo step robotizzato di manipolazione dei liquidi. Sono disponibili anche kit commerciali già pronti per l'esecuzione di saggi particolari, come ad esempio quello per l'influenza A + B. A richiesta sono disponibili piani di assistenza personalizzati.
LightCycler System (Roche)
Roche offre un'ampia gamma di termociclatori specifici per qPCR, tutte appartenenti alla fortunata serie LightCycler. Si comincia con LightCycler Nano System, la più piccola macchina di RT-PCR disponibile sul mercato, che consente di analizzare in parallelo fino a 32 campioni (in 4 strip da 8 pozzetti ciascuna) e di elaborare i risultati con un software per Windows o Mac. Sempre di 32 campioni è la capacità del LightCycler Carousel-Based System, dotato di sei diversi canali di rilevamento. LightCycler 96 System è invece un termociclatore di dimensioni medie, che consente l'analisi di 96 campioni in parallelo, in strip o in piastra. Passando alle piattaforme Roche a resa elevata (high-throughput), si arriva alla LightCycler 480 System e alla LightCycler 1536 System, entrambe ideali per l'analisi di DNA o cDNA di un elevato numero di campioni in parallelo, anche in multiplexing, in tempi estremamente rapidi (50 minuti circa).
Sistema CFX (Biorad)
Fra le più quotate in assoluto, tutte le macchine della serie CFX di Biorad sono dotate della possibilità di analizzare i campioni sia singolarmente che in multiplexing. Le macchine della serie CFX sono costituite da un termociclatore e da un blocco di rilevamento ottico per il rilevamento dei fluorofori. Il software di gestione di queste macchine, accessibile dal touchpad di comando, offre anche un programma di creazione automatizzata del protocollo di amplificazione (autowriter), in grado di generare il protocollo più adatto in base alla polimerasi utilizzata, ai primers e alla lunghezza che si desidera per l'amplificato. Le macchine Biorad sono dotate di uno speciale blocco con struttura a nido d'ape (honeycomb) che rende più rapide le fasi di riscaldamento e raffreddamento. Numerosi i modelli per tutte le esigenze: dalla CFX96 alla CFX 384 alla CFX Connect e oltre. Per un'animazione su sul funzionamento della tecnologia Biorad consigliamo questo link (l'animazione è interattiva e divertente).
Fragment Analyzer (Advanced Analytical)
Il Fragment Analyzer™ Automated CE System di Advanced Analytical è un sistema basato sull'elettroforesi capillare e l'utilizzo della fluorescenza. Il sistema utilizza un dye intercalante molto sensibile che grazie all'impiego di una fonte di luce LED estremamente sensibile elimina la necessità dei primer marcati con fluorocromi. È possibile far correre 12 o 96 campioni in parallelo. La ditta fornisce dei kit per i seguenti usi: quantificazione e qualificazione di frammenti NGS, di RNA, di DNA genomico, rilevazione di mutazione e fragment length analysis (per dimensionamento allelico da 10 a 40.000 bp, con una risoluzione fino a 2 bp).
Mx3000P - Mx3005P System (Agilent Technologies)
Anche Agilent Technologies è all'avanguardia nei sistemi di PCR quantitativa. Stiamo parlando dei sistemi Mx3000P e Mx3005P. Citate in più di 3.000 pubblicazioni scientifiche, le Mx3000P e Mx3005P sono macchine flessibili e affidabili, che possono essere usate per tutti tipi di applicazioni tipici della qPCR (studi di espressione, validazione di microarray, genotipizzazione di varianti, analisi del pattern di metilazione e persino per gli studi ChIP - chromatin immunoprecipitation). Le macchine funzionano in coppia con il software MxPro.
Rotor-Gene Q (Qiagen)
Decisamente sorprendente dal punto di vista ingegneristico è la Rotor-Gene Q di Qiagen, un termociclatore all'interno del quale i campioni, invece che giacere su un blocco termico fisso, vengono fatti rotare su una centrifuga in una camera dove vengono iniettate aria calda o fredda. Questo sistema garantisce un livello costante di temperatura su tutti i campioni e un rapido processo di termociclazione. Ad ogni rotazione della centrifuga ciascuna provetta passa in corrispondenza del sistema ottico della macchina, che illumina il campione e raccoglie al tempo stesso il segnale fluorescente sprigionato. Qiagen ha prodotto delle pagine esplicative molto belle e un formidabile riassunto video, che consigliamo di vedere qui.
Come altre macchine qPCR, anche Rotor-Gene Q può essere utilizzata sia per studi di espressione, che per SNP genotyping che per analisi di metilazione (EpiTect HRM PCR Kit).
SmartCycler (Cepheid)
SmartCycler di Cepheid è disponibile in diverse configurazioni per l'analisi in parallelo di 16, 32, 48, 64, 80 o 96 campioni. Sorprendente è la flessibilità del sistema SmartCycler, che offre la possibilità di far correre in parallelo reazioni con protocolli di amplificazione diversi. Non solo: gli esperimenti possono essere iniziati in momenti diversi e dunque più operatori possono utilizzare contemporaneamente la stessa macchina. SmartCycler consente anche di fare reazioni in multiplexing.
Exicycler™ 96 Quantitative Real-Time PCR System (Bioneer)
Exicycler 96 di Bioneer è un sistema a 5 colori basato su una tecnologia light tunnel che non necessita dell'impiego di un dye di riferimento. Il sistema Exicycler 96 è stato studiato per eliminare l'effetto bordo (edge-effect). Molte macchine per qPCR (anche se non tutte) sono dotate di sistemi di illuminazione dei campioni dall'alto, il che può causare una riduzione fino al 30% dell'illuminazione dei campioni posti nelle zone periferiche della piastra. La tecnologia light tunnel di Exicycler consente di irradiare ciascun pozzetto con lo stesso numero di fotoni, eliminando la necessità di utilizzare dyes di riferimento per aggiustare le differenze di intensità della luce.
Exicycler è un sistema aperto (open system), che può essere utilizzato con tutti i tipi di reagenti e di consumables. Tutti i dati della fluorescenza vengono salvati nel sistema, indifferentemente dal modo in cui l'esperimento è stato preparato, così che i dati stessi possono essere recuperati anche nel caso in cui la piastra venga accidentalmente dimenticata fuori dalla macchina.
Fra le più quotate in assoluto, tutte le macchine della serie CFX di Biorad sono dotate della possibilità di analizzare i campioni sia singolarmente che in multiplexing. Le macchine della serie CFX sono costituite da un termociclatore e da un blocco di rilevamento ottico per il rilevamento dei fluorofori. Il software di gestione di queste macchine, accessibile dal touchpad di comando, offre anche un programma di creazione automatizzata del protocollo di amplificazione (autowriter), in grado di generare il protocollo più adatto in base alla polimerasi utilizzata, ai primers e alla lunghezza che si desidera per l'amplificato. Le macchine Biorad sono dotate di uno speciale blocco con struttura a nido d'ape (honeycomb) che rende più rapide le fasi di riscaldamento e raffreddamento. Numerosi i modelli per tutte le esigenze: dalla CFX96 alla CFX 384 alla CFX Connect e oltre. Per un'animazione su sul funzionamento della tecnologia Biorad consigliamo questo link (l'animazione è interattiva e divertente).
Fragment Analyzer (Advanced Analytical)
Il Fragment Analyzer™ Automated CE System di Advanced Analytical è un sistema basato sull'elettroforesi capillare e l'utilizzo della fluorescenza. Il sistema utilizza un dye intercalante molto sensibile che grazie all'impiego di una fonte di luce LED estremamente sensibile elimina la necessità dei primer marcati con fluorocromi. È possibile far correre 12 o 96 campioni in parallelo. La ditta fornisce dei kit per i seguenti usi: quantificazione e qualificazione di frammenti NGS, di RNA, di DNA genomico, rilevazione di mutazione e fragment length analysis (per dimensionamento allelico da 10 a 40.000 bp, con una risoluzione fino a 2 bp).
Mx3000P - Mx3005P System (Agilent Technologies)
Anche Agilent Technologies è all'avanguardia nei sistemi di PCR quantitativa. Stiamo parlando dei sistemi Mx3000P e Mx3005P. Citate in più di 3.000 pubblicazioni scientifiche, le Mx3000P e Mx3005P sono macchine flessibili e affidabili, che possono essere usate per tutti tipi di applicazioni tipici della qPCR (studi di espressione, validazione di microarray, genotipizzazione di varianti, analisi del pattern di metilazione e persino per gli studi ChIP - chromatin immunoprecipitation). Le macchine funzionano in coppia con il software MxPro.
Rotor-Gene Q (Qiagen)
Decisamente sorprendente dal punto di vista ingegneristico è la Rotor-Gene Q di Qiagen, un termociclatore all'interno del quale i campioni, invece che giacere su un blocco termico fisso, vengono fatti rotare su una centrifuga in una camera dove vengono iniettate aria calda o fredda. Questo sistema garantisce un livello costante di temperatura su tutti i campioni e un rapido processo di termociclazione. Ad ogni rotazione della centrifuga ciascuna provetta passa in corrispondenza del sistema ottico della macchina, che illumina il campione e raccoglie al tempo stesso il segnale fluorescente sprigionato. Qiagen ha prodotto delle pagine esplicative molto belle e un formidabile riassunto video, che consigliamo di vedere qui.
Come altre macchine qPCR, anche Rotor-Gene Q può essere utilizzata sia per studi di espressione, che per SNP genotyping che per analisi di metilazione (EpiTect HRM PCR Kit).
SmartCycler (Cepheid)
SmartCycler di Cepheid è disponibile in diverse configurazioni per l'analisi in parallelo di 16, 32, 48, 64, 80 o 96 campioni. Sorprendente è la flessibilità del sistema SmartCycler, che offre la possibilità di far correre in parallelo reazioni con protocolli di amplificazione diversi. Non solo: gli esperimenti possono essere iniziati in momenti diversi e dunque più operatori possono utilizzare contemporaneamente la stessa macchina. SmartCycler consente anche di fare reazioni in multiplexing.
Exicycler™ 96 Quantitative Real-Time PCR System (Bioneer)
Exicycler 96 di Bioneer è un sistema a 5 colori basato su una tecnologia light tunnel che non necessita dell'impiego di un dye di riferimento. Il sistema Exicycler 96 è stato studiato per eliminare l'effetto bordo (edge-effect). Molte macchine per qPCR (anche se non tutte) sono dotate di sistemi di illuminazione dei campioni dall'alto, il che può causare una riduzione fino al 30% dell'illuminazione dei campioni posti nelle zone periferiche della piastra. La tecnologia light tunnel di Exicycler consente di irradiare ciascun pozzetto con lo stesso numero di fotoni, eliminando la necessità di utilizzare dyes di riferimento per aggiustare le differenze di intensità della luce.
Exicycler è un sistema aperto (open system), che può essere utilizzato con tutti i tipi di reagenti e di consumables. Tutti i dati della fluorescenza vengono salvati nel sistema, indifferentemente dal modo in cui l'esperimento è stato preparato, così che i dati stessi possono essere recuperati anche nel caso in cui la piastra venga accidentalmente dimenticata fuori dalla macchina.
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