Come anticipato nella lezione LE MUTAZIONI DELLO SPLICING, le mutazioni dello splicing non sono solamente quelle che colpiscono le prime o le ultime due posizioni nucleotidiche introniche (GT, sito donatore di splicing, o AG, sito accettore di splicing). Infatti, esistono anche mutazioni che attivano siti criptici di splicing, in modo diretto (attivazione diretta) o in modo indiretto (attivazione indiretta). In aggiunta, alcune mutazioni possono impattare a distanza l'attività dei siti conservati GT e AG: si tratta delle mutazioni localizzate nelle prime dieci-venti posizioni nucleotidiche dal confine esone/introne (in realtà, fra tutte le mutazioni atipiche, queste sono forse le più frequenti). Vediamo un esempio di quest ultimo dipo di mutazione: la mutazione c.81+4A>G nel gene COL4A5, descritta da Hanson H et al (2011, PMID: 20884774). Questa mutazione colpisce il quarto nucleotide intronico nell'introne 1. L'effetto di questa mutazione non genera un sito criptico di splicing di per sè, semplicemente impatta il vicino sito donatore GT, abolendone l'attività.
Eseguire uno screening per tutte queste mutazioni non è facile, poichè con le tecniche diagnostiche di routine ad oggi disponibili le regioni introniche profonde non vengono analizzate. Per quanto riguarda le mutazioni dello splicing localizzate negli esoni, è necessario che il biologo o il genetista sia consapevole del fatto che anche una mutazione cosiddetta sinonima (cioè che non altera la sequenza aminoacidica della proteina) può essre patogena, in quanto possibile causa di splicing aberrante. Le mutazioni dello splicing localizzate a poca distanza dal confine esone/introne sono poi difficili da valutare. L'unico strumento adeguato è l'analisi in silico, cioè con software appositi. In effetti una mutazione localizzata entro i primi 10-20 nucleotidi dal confine esone/introne può essere tanto patogena quanto neutrale.
Forse il software migliore per l'analisi in silico delle mutazioni "atipiche" dello splicing è Alamut (Interactive Biosoftware, a pagamento), che integra il risultato di cinque software diversi (SpliceSiteFinder-like, MaxEntScan, NNSplice, GeneSplicer, Human Splicing Finder). La lettura della cosiddetta splicing window di Alamut non è molto intuitiva. Il produttore fornisce tuttavia alcune istruzioni ed esiste anche un articolo scientifico di grande utilità nel capire come intepretare i punteggi computati da questo software (PMID: 21780003).
Eseguire uno screening per tutte queste mutazioni non è facile, poichè con le tecniche diagnostiche di routine ad oggi disponibili le regioni introniche profonde non vengono analizzate. Per quanto riguarda le mutazioni dello splicing localizzate negli esoni, è necessario che il biologo o il genetista sia consapevole del fatto che anche una mutazione cosiddetta sinonima (cioè che non altera la sequenza aminoacidica della proteina) può essre patogena, in quanto possibile causa di splicing aberrante. Le mutazioni dello splicing localizzate a poca distanza dal confine esone/introne sono poi difficili da valutare. L'unico strumento adeguato è l'analisi in silico, cioè con software appositi. In effetti una mutazione localizzata entro i primi 10-20 nucleotidi dal confine esone/introne può essere tanto patogena quanto neutrale.Forse il software migliore per l'analisi in silico delle mutazioni "atipiche" dello splicing è Alamut (Interactive Biosoftware, a pagamento), che integra il risultato di cinque software diversi (SpliceSiteFinder-like, MaxEntScan, NNSplice, GeneSplicer, Human Splicing Finder). La lettura della cosiddetta splicing window di Alamut non è molto intuitiva. Il produttore fornisce tuttavia alcune istruzioni ed esiste anche un articolo scientifico di grande utilità nel capire come intepretare i punteggi computati da questo software (PMID: 21780003).
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